微生物的分離是指將目標(biāo)菌種從微生物群體（尤其是不同微生物群體）中分離出來(lái)的技術(shù)，是微生物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也是嘉興無(wú)菌檢驗(yàn)員培訓(xùn)學(xué)員必須要掌握的內(nèi)容。微生物的分離培養(yǎng)方法主要有三種：劃線(xiàn)分離法，涂布平板法和傾注平板法。本文先為大家說(shuō)說(shuō)涂布平板法。

嘉興無(wú)菌檢驗(yàn)員培訓(xùn)之涂布平板法

1.定義：

待分離微生物樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度（一般10倍遞增）稀釋后，使微生物菌體充分分散，成為單細(xì)胞，然后再取出一定量，涂布到固體培養(yǎng)基表面的方法，再經(jīng)過(guò)適宜的培養(yǎng)條件，形成單菌落的過(guò)程。

2.目的：

(1)獲得純培養(yǎng)物-目標(biāo)菌。

(2)獲得純培養(yǎng)在微生物雜菌中的數(shù)量或比例—平板計(jì)數(shù)。

3.梯度稀釋步驟：

(1)稱(chēng)量：準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)樣品1g或量取待測(cè)樣品1mL。

(2)稀釋?zhuān)簩⑸鲜鰳悠贩湃胙b有99mL無(wú)菌生理鹽水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，記錄。

(3)搖勻：將上述三角瓶放置于搖床上振蕩30min，使微生物細(xì)胞充分分散，靜置20-30s，即成10-2稀釋液。

(4)繼續(xù)稀釋?zhuān)涸儆?mL無(wú)菌移液器，吸取上述稀釋液1mL，移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液和水混合均勻，即成10-3稀釋液。

(5)繼續(xù)稀釋?zhuān)涸贀Q一支無(wú)菌移液器，吸取10-3稀釋液1mL，移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，即成10-4稀釋液。

(6)繼續(xù)稀釋?zhuān)阂源祟?lèi)推，連續(xù)梯度稀釋?zhuān)瞥?0-7、10-8、10-9 等一系列稀釋菌液。

4.涂布平板步驟：

(1)標(biāo)記：將事先制備好的無(wú)菌平板上標(biāo)記10-7、10-8、10-9，每一個(gè)梯度稀釋設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

(2)涂布：用無(wú)菌移液器分別吸取10-7稀釋液0.1mL放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中，然后用涂布棒或涂布器將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)涂布器，用完涂布器酒精燈灼燒滅菌。

(3)繼續(xù)涂布：同樣涂布10-8稀釋液和10-9稀釋液，切記更換涂布棒。

(4)培養(yǎng)：將涂布好的平板平放于超凈臺(tái)上靜置10min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

(5)計(jì)數(shù)：至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。

(6)保存：將單菌落平板儲(chǔ)存至4℃保存。

5.計(jì)數(shù)原則：

(1)計(jì)數(shù)原則，平板上菌落數(shù)30-300個(gè)為合格。

(2)如果只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)，則以該稀釋度平均菌落數(shù)除以涂布平板所用稀釋液體積(0.1mL)，乘以稀釋倍數(shù)作為該樣品的細(xì)菌總數(shù)。

(3)如果有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合要求，則按照兩者菌落總數(shù)之比來(lái)決定，如果小于2，取兩者的平均值如果大于2，取較小的菌落總數(shù)。

6.操作技巧：

(1)前幾個(gè)稀釋梯度，尤其是第一個(gè)梯度適當(dāng)放大稀釋倍數(shù)。

這樣不容易丟失目標(biāo)菌，也可以很好地對(duì)樣品進(jìn)行溶解。

(2)學(xué)會(huì)使用玻璃珠。

玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或顆粒性樣品，可以將顆粒表面微生物與液體充分接觸。

(3)勤換槍頭或移液管。

這樣不容易造成不同稀釋度間混亂，防止不同梯度間取樣不準(zhǔn)。

(4)一定要搖勻。

平板涂布法的難點(diǎn)就在于稀釋?zhuān)♂尣粶?zhǔn)確后面一切都化為零，一定要搖勻再取樣。

(5)利用顯微鏡粗略估測(cè)稀釋倍數(shù)。

并不是每一個(gè)樣品都需要稀釋到10-9，而是要根據(jù)樣品中微生物的數(shù)量進(jìn)行稀釋。

(6)涂布完成后，靜置10min再倒置培養(yǎng)。

靜置有利于微生物在培養(yǎng)基表面吸附，直接倒置培養(yǎng)，可能倒置菌液向一側(cè)流動(dòng)。

(7)倒固體培養(yǎng)基的時(shí)候，可以適當(dāng)吹干或提前一到兩天倒平板。

平板表面沒(méi)有多余水分且比較濕潤(rùn)，涂布時(shí)候既容易涂開(kāi)也不會(huì)造成出現(xiàn)菌苔。

7.注意事項(xiàng)：

(1)注意涂布力度，大小適宜，不應(yīng)劃破培養(yǎng)基的表面。

(2)如果發(fā)現(xiàn)平板上水太多，處理后再使用。

(3)切記寫(xiě)清楚標(biāo)記。

(4)試驗(yàn)完畢，注意灼燒涂布器，以免影響環(huán)境，造成交叉污染。

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