菌種的保存、復蘇、傳代是無菌檢驗員必備知識和能力之一，也是無菌檢驗員培訓的基礎知識?？紤]到相關內(nèi)容較多，先來說說凍干菌種的復蘇。

無菌檢驗員培訓知識之菌種的復蘇

1、凍干菌種的復蘇

1.1復蘇菌種前應準備適于菌種生長的固體、液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)設備，所有操作均應在合適的生物安全防護條件下進行。

1.2用75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜內(nèi)使用尖嘴鉗去除塑料蓋及鋁蓋，注意不要同時打開膠塞。緩慢開啟膠塞，用75%酒精棉消毒瓶口部分，將液體培養(yǎng)基吸取至菌株西林瓶內(nèi)，溶 解凍干物。

1.3旋緊旋蓋，讓菌懸液在振蕩 器上混勻約 10s促使溶解均勻。

1.4 將菌懸液吸出，接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)。用接種環(huán)取菌液劃線接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基上。

1.5 將已接種的液體培養(yǎng)基及瓊脂斜面培養(yǎng)基置規(guī)定溫度下（一般細菌在30~35℃，真菌在20~25℃）培養(yǎng)24h。

1.6 取出培養(yǎng)物（第1代），仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌，必要時涂片、革蘭氏染色鏡檢，若呈典型菌落即可應用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進行平板分離單菌落。

2、為保證工作用菌株的傳代次數(shù)不超過5代，并減少購買凍干菌種的次數(shù)，可在對凍干菌種復蘇的同時制備部分菌懸液（第1代）冷凍保存，并將此凍存菌液復蘇后的第2代培養(yǎng)物凍存保藏。

2.1準備 ：

①凍存保護液（40%無菌甘油）及滅菌凍存管。

②細菌凍存液：由液體培養(yǎng)基與凍存保護液按1：1比例混勻制成。

3、凍存菌懸液的復蘇

3.1準備：

①用具：移液槍、酒精燈、接種環(huán)。

②培養(yǎng)基：根據(jù)菌種的特性選擇適宜的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基等）、瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基。

③消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液等。

3.4   將上述接種后的培養(yǎng)基在規(guī)定溫度下培養(yǎng)（細菌在30~35℃恒溫培養(yǎng)18-24小時，真菌在20~25℃恒溫培養(yǎng)24-48小時，黑曲霉*培養(yǎng)5~7天）。

3.5  仔細觀察培養(yǎng)物：如呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種，注明菌名、編號、代次和接種日期后，置2~8℃冰箱內(nèi)保存；如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可進行平板分離單菌落。